ELISA（酶联免疫吸附测定，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay） 是一种常用于检测和定量分析样品中目标分子（如抗体、抗原、细胞因子等）浓度的免疫学方法。ELISA的原理基于抗原与抗体之间的特异性结合，并通过酶催化反应产生可测量的信号（通常是颜色变化或荧光）。以下是ELISA的基本原理及其步骤：

1. 基本原理

ELISA的核心原理是通过利用抗原和抗体之间的特异性结合反应，在固相载体（通常是96孔板）上捕获目标分子，并使用酶标记的二抗或抗原与目标分子结合，最终通过酶催化底物反应产生可测量的信号（如颜色变化、荧光或化学发光），从而推算出目标分子的浓度。

具体步骤包括：抗原（或抗体）固定、样品加入、特异性结合、酶标记反应、底物反应、信号读取。

2. ELISA的工作步骤

1) 固相载体的准备

• 固定抗原或抗体：ELISA实验通常使用固相载体（如96孔微孔板）来固定样品中的抗原或抗体。这一步骤可以通过物理吸附或化学交联的方式进行，将抗原或抗体牢固地固定在孔板表面。

2) 样品加入

• 样品添加：将待检测的样品（如血清、尿液、细胞培养液等）加入到每个孔中。如果样品中含有目标抗原或抗体，这些分子将与固定在孔板上的抗原或抗体发生特异性结合。

3) 孵育与洗涤

• 孵育反应：在一定温度下孵育一定时间，确保抗原-抗体反应完成。

• 洗涤：孵育后，通过洗涤液清除未结合的分子，确保孔中只残留已结合的目标物质。

4) 酶标记的二抗加入

• 加入酶标记物：将带有酶标记（如辣根过氧化物酶HRP、碱性磷酸酶AP等）的二抗或二抗抗原添加到每个孔中。这些酶标记物会与样品中的目标分子（如抗体或抗原）结合，形成免疫复合物。

5) 底物反应

• 加入底物：添加酶底物，酶与底物反应生成可检测的信号，通常表现为颜色的变化。酶催化反应的产物与酶的浓度成正比，而酶的浓度又与目标分子的浓度成正比。

  • 对于HRP，常用的底物为TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺），与HRP反应会产生蓝色或黄色的产物。

  • 对于AP，常用的底物是p-Nitrophenylphosphate（pNPP），与AP反应生成黄色化合物。

6) 信号检测

• 读取信号：使用酶标仪（ELISA reader）测量反应后的颜色变化。颜色的深浅与样品中目标分子的浓度成正比。通常通过测量吸光度（OD值）来获取数据，吸光度值越高，目标分子的浓度也就越高。